蛋白質，造成蛋白質資源的損失。本研究目的是為研究纖維素酶和果膠酶對中性蛋白酶水解棉籽粕蛋白質效果的影響，以確定適宜的NSP酶水平。
1 材料和方法
1.1 試驗設計
本研究由三個試驗組成：試驗一設7個處理，研究纖維素酶水平（0、350、700、1050、1 400 U/g棉籽粕）對還原糖生成量、蛋白質水解度（degree of hydrolysis,DH）和三氯乙酸氮溶指數（trichloroacetic acid-nitrogen solution index ，TCA－NSI）的影響，各處理8個重復；試驗二設7個處理，研究果膠酶水平（0、250、500、750、1 000 U/g棉籽粕）對還原糖生成量、DH和TCA-NSI的影響，各處理8個重復；試驗三采用2×2因子試驗設計研究纖維素酶和果膠酶合用對還原糖生成量、DH和TCA-NSI的影響：纖維素酶水平分別為350、1 400 U/g棉籽粕，果膠酶水平分別為250、1 000 U/g棉籽粕，各處理8個重復。
1.2 酶的來源和特性
本試驗用的纖維素酶、果膠酶和中性蛋白酶為愛頓飼料有限公司生產。酶的特性見表1。
表1 酶的特性

Table 1. Character of the enzymes ℃、U/g

名稱
最適pH值
最適溫度
酶活力

纖維素酶

果膠酶

中性蛋白酶
4.8

5.3

7.0
45

50

50
180 000

20 000

40 000

註：AU是指LAPU是指每分鐘水解1毫摩爾L-亮氨酸-對硝基苯胺即是1個單位
試驗前，NSP酶用0.2 mol/L，pH 5.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液溶解，配製成濃度為500 U/mL溶液；中性蛋白酶用Ph 7.0 0.2 mol/L磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液溶解，配製成濃度為1 000 U/mL溶液。
1.3 酶解方法
本試驗用棉籽粕購自雅安聖通飼料有限責任公司。淺黃色，無酸敗、黴變、焦化等異味。粗蛋白：39.53%。棉籽粕於65℃烘幹，粉碎過50目，混合均勻，密封保存。稱取2 g棉籽粕，加蒸餾水，使料水比為1∶6，調節pH至5.0，加入NSP酶，於溫度50℃，轉速120 r/min的搖床裏反應5 h；然後調節pH至7.0，加入中性蛋白酶500 U/g棉籽粕，於溫度50℃，轉速120 r/min的搖床裏反應5 h，最後升溫至80℃滅酶活30 min以終止反應。
1.4 試驗所用的儀器和藥品
主要試劑為：硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、甲醛、氫氧化鈉、過氧化氫、三氯乙酸、酒石酸鉀鈉、乙酸鋅、冰乙酸、葡萄糖、鹽酸、亞鐵氰化鉀、均為分析純；主要儀器為：pHS-3C精密pH計、HZS-H水浴振蕩器、90-1型恒溫磁力攪拌器、電子天平。
1.5 衡量酶解效果的指標及測定方法
1.5.1 還原糖生成量：酶解產品用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液沈澱後過濾，用濾液來測定還原糖生成量。參照黃曉鈺、劉鄰渭(2002)[5]《食品化學綜合實驗》進行。
還原糖生成量(以葡萄糖計)(%) = 酶解液中還原糖量 / 原料的重量 × 100
還原糖生成量反映細胞壁降解程度的指標。
1.5.2 DH：酶解產品用20%三氯乙酸沈澱後過濾，用濾液來測定氨基氮含量。
氨基氮含量采用甲醛滴度法測定。參照黃曉鈺、劉鄰渭(2002)[5]《食品化學綜合實驗》進行。
DH(%) = 氨基氮含量 / 原料總氮含量 × 100
DH是反映蛋白質降解程度的指標。
1.5.3 TCA－NSI：酶解產品加入等體積的20%三氯乙酸靜置後過濾，用濾液來測定氮含量。參照黃曉鈺、劉鄰渭(2002)[5]《食品化學綜合實驗》進行。
TCA-NSI(%)= 濾液中的氮 / 原料總氮含量 × 100
DH是反映蛋白質降解程度的指標。
1.5.4 原料總氮含量：采用凱氏定氮法，測定方法參照楊勝主編(1993)[6]《飼料分析及飼料質量檢測技術》。
1.6 數據處理及統計分析
結果采用平均數±標準差表示；采用SPSS11.0對數據進行ANOVO方差分析、Ducan法進行多重比較和回歸分析及相關分析。
2 結果與分析
2.1 纖維素酶水平對蛋白酶酶解效果的影響
由表2、圖1、圖2知，當中性蛋白酶水平為500 U/g棉籽粕時，隨著纖維素酶水平的增加，還原糖生成量、DH和TCA-NSI極顯著增加(p<0.01)，當纖維素酶水平達350 U/g後，DH和TCA-NSI的增加的趨勢變得緩和。

表2 纖維素酶水平對還原糖生成量、DH和TCA-NSI的影響

Table 2. Effect of the cellulase level on the production of reducing sugar ，degree of hydrolysis and trichloroacetic acid-nitrogen solution index %

處理
纖維素酶（U/g棉籽粕）
還原糖生成
DH
TCA-NSI

1

2

3

4

5
0

350

700

1050

1400
0.51±0.00A

1.97±0.08B

3.57±0.03C

5.00±0.03D

6.30±0.03E
6.05±0.09A

7.80±0.11B

8.40±0.03C

8.71±0.07D

8.96±0.05E
33.18±0.22A

45.19±0.41B

48.17±0.49C

49.65±0.09D

51.72±0.19E

註：同列肩註不同大寫字母代表差異極顯著(p<0.01)；同列肩註不同小寫字母代表差異顯著（p<0.05）；同列肩註相同小寫字母代表差異不顯著（p>0.05），以下各表與此相同

圖 1 纖維素酶水平對還原糖生量的影響 圖 2 纖維素酶水平對DH和TCA-NSI的影響

Figure 1. Effect of the cellulase level on Figrue 2. Effect of the cellulase level on the degree of

production of reducing sugar hydrolysis,,trichloroaceticacid-nitrogen solution index

分別建立還原糖生成量(y1，%)與纖維素酶水平（x1，U/g棉籽粕）、DH（y2，%）與纖維素酶水平（x2，U/g棉籽粕）、 TCA-NSI（y3，%）與纖維素酶水平（x3，U/g棉籽粕）的二次回歸方程：
y1=0.476274A＋0.004569Ax1―2.797813E-07Ax12 (p<0.01，R2＝1.00)
y2＝6.146831A＋0.004589Ax2―1.887373E-06Ax22 (p<0.01，R2＝0.98)
y3=33.984518A＋0.029905Ax3―1.277471E-05Ax32 (p<0.01，R2＝0.96)
系數肩註A代表—極顯著（p<0.01）。
當中性蛋白酶水平為500 U/g棉籽粕，酶解時間為5 h時，y1方程尋優求得：纖維素酶的最優水平為2 165.3 U/g棉籽粕，還原糖生成量為9.13%；y2方程尋優求得：纖維素酶最優水平為1 215.7 U/g棉籽粕，DH為8.94%；y3方程尋優求得：纖維素酶最優水平為1 170.5 U/g棉籽粕，TCA-NSI為51.49%。
進行相關分析：DH和TCA-NSI與還原糖生成量之間、DH與TCA-NSI之間的相關系數分別為0.922（p<0.01），0.887(p<0.01)，0.997(p<0.01)。
2.2 果膠酶水平對蛋白酶酶解效果的影響
由表3，當中性蛋白酶水平為500U/g棉籽粕時，隨著果膠酶水平的增加，還原糖生成量和TCA-NSI極顯著增加（p<0.01）、DH顯著增加（p<0.05）。由圖3、和圖4知，當果膠酶水平達250U/g後，還原糖生成量和TCA-NSI呈極顯著增加(p<0.01)，DH呈顯著增加（p<0.05），但是DH和TCA-NSI增加的量很小。
表3 果膠酶水平對還原糖生成量、DH和TCA-NSI的影響

Table 3. Effect of the pectinase level on the production of reducing sugar ，degree of hydrolysis and trichloroacetic acid-nitrogen solution index U/g、%

處理
果膠酶
還原糖生成量
DH
TCA-NSI

1

2

3

4

5
0

250

500

750

1000
0.52±0.00A

3.39±0.03B

4.58±0.04C

5.63±0.07D

6.30±0.03E
5.53±0.15Aa

6.06±0.15Bb

6.44±0.14Cc

6.71±0.09CDd

6.92±0.13De
32.50±0.27A

34.11±0.18B

36.10±0.19C

37.56±0.21D

38.44±0.16E

註：同上

圖 3 果膠酶水平對還原糖生成量的影響 圖 4 果膠酶水平對DH和TCA-NSI的影響
Figure 3. Effect of the pectinase level Figure 4. Effect of the pectinase level on
on the production of reducing sugar the degree of hydrolysis and trichloroacetic
acid-nitrogen solution index
分別建立還原糖生成量(y1，%)與果膠酶水平（x1，U/g棉籽粕）、DH（y2，%）與果膠酶水平（x2，U/g棉籽粕）、TCA-NSI（y3，%）與果膠酶水平（x3，U/g棉籽粕）的二次回歸方程：
y1=0.657481A+0.010465Ax1-4.770212E-06Ax12 (p<0.01，R2＝0.99)
y2=5.542136A+0.002211Ax2-8.461610E-07Ax22 (p<0.01，R2＝0.95)
y3=32.493079A+0.008714Ax3-2.737430E-06Ax32 (p<0.01，R2＝0.99)
系數肩註A代表—極顯著(p<0.01)。
當中性蛋白酶水平為500 U/g棉籽粕，酶解時間為5 h時，y1方程尋優求得：果膠酶最優水平為1 096.9 U/g棉籽粕，還原糖生成量為6.40%； y2方程尋優求得：果膠酶最優水平為1 306.5 U/g棉籽粕，DH為6.98%；y3方程尋優求得：果膠酶最優水平為1 519.6 U/g棉籽粕，TCA-NSI為39.43%。
進行相關分析：DH和TCA-NSI與還原糖生成量之間、DH與TCA-NSI之間的相關系數分別為：0.971（p<0.01）、0.972（p<0.01）和0.944(p<0.05)。
2.3 纖維素酶和果膠酶合用對蛋白酶酶解效果的影響
由表4知，在高低果膠酶水平上，還原糖生成量、DH和TCA-NSI隨著纖維素酶水平的增加而極顯著增加(p<0.01)。同樣，在高低纖維素酶水平上，還原糖生成量、DH和TCA-NSI隨著果膠酶水平的增加而極顯著增加(p<0.01）。而各處理間還原糖生成量、DH和TCA-NSI差異極顯著（p<0.01）。
表4 纖維素酶和果膠酶合用對還原糖生成量、DH和TCA-NSI的影響

Table 4. Effect of the cellulase and pectinase on the production of reducing sugar ，degree of hydrolysis and trichloroacetic acid-nitrogen solution index %

處理

纖維素酶

(U/g棉籽粕)
果膠酶

(U/g棉籽粕)
還原糖生成量

DH

TCA-NSI

1

2

3

4
350

350

1400

1400
250

1000

250

1000
4.93±0.01A

10.55±0.18B

11.40±0.12C

15.50±0.19D
8.19±0.11A

10.16±0.14B

11.09±0.07C

13.62±0.17D
47.01±0.50A

51.10±0.19B

57.69±0.27C

62.00±0.56D

註：同上
對各因素進行重要性分析，各因素的重要性見表5。就還原糖生成量而言，纖維素酶>果膠酶>纖維素酶X果膠酶。就對DH的貢獻而言，纖維素酶>果膠酶>纖維素酶X果膠酶。就TCA-NSI的貢獻而言，纖維素酶>果膠酶,兩者無交互作用。
進行相關分析：DH和TCA-NSI與還原糖生成量之間、DH與TCA-NSI之間的系數分別為：0.980（p<0.01）、0.934（p<0.01）和0.960(p<0.05)。

表5 因素重要性分析

Table 5. Importance analysis of the factors %

因素
貢獻率

還原糖生成量
DH
TCA-NSI

纖維素酶

果膠酶

纖維素酶X果膠酶
6.70

4.92

0.12
2.10

1.02

0.01
0.95

0.14

無互作關系

3 討論
3.1 NSP酶種類對還原糖生成量的影響
棉籽粕中主要的NSP是纖維素、果膠、阿拉伯木聚糖等。本試驗發現，單獨用纖維素酶或果膠酶與中性蛋白酶合用均可極顯著提高酶解棉籽粕的還原糖生成量，說明這兩種酶可以有效地降解纖維素和果膠生成還原糖，這與何中山（2004）[7]在豆粕上的研究有相似之處。何中山（2004）[7]研究發現，就還原糖釋放而言，纖維素酶、果膠酶和甘露聚糖酶都極顯著提高了還原糖生成量。
本試驗發現，與添加果膠酶相比，添加纖維素酶，還原糖生成量平均降低0.765%,降低了18.8%，表明果膠酶優於纖維素酶。
通過2×2因子試驗發現，同時添加纖維素酶和果膠酶具有協同作用，可提高還原糖生成量；且存在交互作用，表現為在纖維素酶水平低時，提高果膠酶水平對還原糖生成量的提高程度大於纖維素酶水平高時；同樣，在果膠酶水平低時，提高纖維素酶水平對還原糖生成量的提高程度大於果膠酶水平高時。
3.2 NSP酶種類對蛋白酶酶解效果的影響
本試驗發現，纖維素酶或果膠酶與中性蛋白酶合用可進一步提高中性蛋白酶對棉籽粕蛋白的水解程度。目前關於NSP酶對蛋白酶水解效果影響的研究報道較少，本試驗結果與一些研究報道相似。高紅巖等（2004）[8]研究發現豆粕經纖維素酶處理之後，水溶性氮增加了60.03%，再用蛋白酶處理可進一步提高蛋白質的溶出率。魏述眾等(1999)[9]果膠酶水解豆粕能增加豆粕蛋白質浸出率。纖維素酶對蛋白酶水解植物蛋白的影響還受纖維素酶加入順序的影響。王金華和夏服寶(2003)[10]研究發現木瓜蛋白酶單酶水解蠶蛹蛋白的氨態氮與總氮比值為0.51，與纖維素酶共同水解蠶蛹蛋白的氨態氮與總氮比值根據加入纖維素酶的先後順序而不同：當先加入纖維素酶、後加入木瓜蛋白酶與同時加入纖維素酶和木瓜蛋白酶，水解蠶蛹蛋白的氨基氮和總氮比值分別為0.62和0.60；而當先加入木瓜白酶，再加纖維素酶與單獨用木瓜蛋白酶酶解的比值間沒有顯著性差異(p<0.05)，表明纖維素酶的加入對木瓜蛋白酶酶解蠶蛹蛋白有明顯的促進作用(p<0.05),可以提高水解液中9%～11%的氨基氮含量。李樹品等(1997)[11]研究發現，NSP酶對蛋白酶水解棉籽蛋白程度的貢獻受蛋白酶水平的影響。在用低水平的166蛋白酶（8 000U/g豆粕），或1 398蛋白酶（9 000 U/g豆粕）單獨水解豆粕時72 h，不同水平纖維素酶對蛋白質消化率的作用效果不存在明顯的差異；但是當提高166蛋白酶用量到20 000 U/g豆粕時，纖維素酶水平為15～20 U/g豆粕，顯著出了效果(李樹品等，1997)[11]。何中山（2004）[7]研究發現，當中性蛋白酶在低水平（500 U/g豆粕）時，高低水平NSP酶之間的DH和TCA-NSI差異極顯著（p<0.01），而當中性蛋白酶在高水平（1 000、1 500、2 000 U/g豆粕）時，高低水平NSP酶之間的DH和TCA-NSI無顯著差異（p>0.05）。因此，關於纖維素酶對蛋白酶水解植物性原料蛋白的影響可能與蛋白酶水平有關。具體原因尚需進一步研究。
本試驗研究發現纖維素酶和果膠酶具有協同作用，可提高蛋白質水解度，且存在交互作用，表現在纖維素酶水平低時，提高果膠酶水平，蛋白質水解度的提高程度大於在纖維素酶水平高時；在果膠酶水平低時，提高纖維素酶水平，蛋白質水解度的提高程度大於在果膠酶高時。目前關於NSP酶聯合應時是否對植物蛋白水解的貢獻存在交互作用研究報道較少。劉誌強和鄧光炳(1999)[12]進行比較發現，成分單一的纖維素酶對提高出油率及蛋白質得率效果不大，而當用NOVO公司的纖維素酶（一種以纖維素酶為主體包含有半纖維素酶、果膠酶組成的混合酶系）能很快使植物細胞壁分解崩潰，且有利於細胞內油脂復合體的釋出和降解，表明，復合酶更能有效提高酶解效果，原因可能是：NSP酶水解植物細胞壁存在明顯的交互作用，因此，經蛋白酶作用之後，也可能存在明顯的交互作用。由於目前在這方面的研究報道較少，具體原因尚需進一步研究。
纖維素酶和果膠酶單獨作用或二者合用均可提高蛋白酶酶解棉籽粕蛋白的程度，NSP酶提高蛋白酶水解棉籽蛋白的原因可能是：1)NSP酶作用於細胞壁，使細胞壁部分降解，破壞細胞壁的結構，纖維素中破壞，釋放出碳水化合物和蛋白質，然後再在蛋白酶的作用下進一步降低，通過蛋白酶的作用達到蛋白質水解的效果(高紅巖，2004)[8]。且本試驗無論先分別單獨使用纖維素酶和果膠酶或二者合用時，還原糖生成量極顯著提高，且還原糖生成量與DH和TCA-NSI存在極顯著的正相關，這就說明存在這種可能性。
本試驗比較纖維素酶（適宜水平350U/g棉籽粕）和果膠酶（適宜水平250U/g棉籽粕）在適宜酶水平（酶解時間均為5小時）時的水解效果發現，纖維素酶水解的還原糖生成量低41.89%、DH提高28.71%、TCA-NSI提高32.17%和成本提高7.70%。與單用果膠酶比較，雙酶合用時還原糖生成量、DH和TCA-NSI分別提高39.53%、 35.15%、37.82%,成本提高107倍。因此，以DH和TCA-NSI為標識，雙酶合用>纖維素酶>果膠酶；成本：雙酶合用>纖維素酶>果膠酶,綜合考慮成本和對DH和TCA-NSI的貢獻，推薦用纖維素酶先水解棉籽粕，再用蛋白酶（500 U/g棉籽粕水解）。
3.3 NSP酶水平對蛋白酶酶解效果的影響
本試驗發現，單獨使用纖維素酶或果膠酶水解棉籽粕時，都能進一步提高中性蛋白酶水解棉籽粕產物的DH和TCA-NSI，且DH和TCA-NSI與纖維素酶水平、果膠酶水平呈二次曲線規律，隨著纖維素酶水平增加而增加，當纖維素酶水平達350 U/g棉籽粕以後，DH和TCA-NSI增加的趨勢變得緩和（見圖2）。因此，以DH和TCA-NSI為標識，確定纖維素酶的適宜水平為350U/g棉籽粕。隨著果膠酶水平增加，DH和TCA-NSI仍增加；但是總的來說，果膠酶水平對DH和TCA-NSI的影響較小，因此，為了節約經濟成本，確定果膠酶的適宜水平為250U/g棉籽粕。
纖維素酶和果膠酶合用時，極顯著提高中性蛋白酶水解棉籽粕蛋白的DH和TCA-NSI（見表4），而且隨著纖維素酶和果膠酶合用時水平的增加，DH和TCA-NSI極顯著性增加。何中山(2004)[7]在豆粕上的研究報道與本試驗結果有相似之處。何中山(2004)[7]在豆粕上研究發現，當蛋白酶在低水平（500 U/g豆粕）時，NSP酶合用時，隨著NSP酶水平的增加，能極顯著提高低水平中性蛋白酶水解豆粕蛋白的DH和TCA-NSI。纖維素酶和果膠酶合用時，纖維素酶或果膠酶水平的提高可提高蛋白質水解程度，存在交互作用：在纖維素酶水平低時，提高果膠酶水平，蛋白質水解度的提高程度小於纖維素酶水平高時；在果膠酶水平低時，提高纖維素酶水平，蛋白質水解度的提高程度小於果膠酶低時。分析原因可能是：隨著NSP酶水平的增加，破壞細胞壁越多，釋放出蛋白質越多，按酶促動力學反應，經蛋白酶作用後，蛋白水解程度增加。目前未見有關於NSP酶合用時不同NSP酶水平適宜組合對蛋白酶水解蛋白程度的研究報道，具體原因尚需進一步研究。
本試驗以DH和TCA-NSI為標識，確定纖維素酶和果膠酶合用時的適宜水平為：纖維素酶350U/g棉籽粕，果膠酶250 U/g棉籽粕，酶解產品中的還原糖生成量為4.93%、DH為8.19%、TCA-NSI為47.01%。
4 結論
在先用NSP酶水解5 h，然後用中性蛋白酶500 U/g棉籽粕水解5 h時，單獨使用纖維素酶或果膠酶均可提高蛋白質水解度和三氯乙酸氮溶指數，適宜水平分別為：纖維素酶350 U/g棉籽粕，果膠酶250 U/g棉籽粕；同時使用纖維素酶和果膠酶，對提高蛋白質水解度具有協同效應，適宜水平為：纖維素酶350 U/g棉籽粕和果膠酶250 U/g棉籽粕。